HIV實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃

HIV 實(shí) 驗(yàn) 室 規(guī) 劃

人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)及其相關(guān)標(biāo)志的檢測是預(yù)防HIV感染和艾滋病臨床治療中重要的環(huán)節(jié)，在艾滋病的防治工作中具有重要作用，如艾滋病的診斷、HIV感染的診斷、血源及器官供體的篩選、流行病學(xué)調(diào)查、艾滋病病人及HIV感染者的病情動態(tài)觀察、臨床治療療效考核以及HIV實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃的安全性和效果鑒定等。

HIV感染標(biāo)志分為病毒標(biāo)志、免疫標(biāo)志和相關(guān)標(biāo)志三大類。病毒標(biāo)志是指直接從HIV感染者體內(nèi)分離出病毒或檢出HIV組成成分(抗原或核酸)。免疫標(biāo)志是指HIV感染所產(chǎn)生的HIV抗原、抗體等免疫物質(zhì)。相關(guān)標(biāo)志是指HIV感染后與艾滋病病情進(jìn)展有密切關(guān)系的某些標(biāo)志，如CD4細(xì)胞、CD8細(xì)胞，β2微球蛋白、有關(guān)細(xì)胞因子等。這些標(biāo)志的測定可為HIV感染及臨床療效的考核提供極為重要的診斷、治療和預(yù)后指征。目前實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃的檢測是艾滋病實(shí)驗(yàn)室檢測中最常用的方法，因?yàn)镠IV抗體是患者感染HIV后最容易檢出并且持續(xù)時間最長的免疫學(xué)標(biāo)志，而且抗體的檢測方法大多簡便、經(jīng)濟(jì)，易于推廣應(yīng)用。

在介紹各種HIV實(shí)驗(yàn)室診斷方法之前，為了使實(shí)驗(yàn)室工作人員能夠有效地確保結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、優(yōu)質(zhì)，我們必須對作為一種感染因子的HIV以及由它所導(dǎo)致的致命性危害有基本的認(rèn)識。實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)特別注意病毒的結(jié)構(gòu)、抗原組成，人體的免疫反應(yīng)，診斷試驗(yàn)的基本原理、試驗(yàn)結(jié)果的解釋，以及為了準(zhǔn)確而有效地提供實(shí)驗(yàn)診斷所必需的質(zhì)量保證措施。如果由于缺乏技術(shù)專長或基本知識而造成不正確的試驗(yàn)結(jié)果是不可原諒的?，F(xiàn)將有關(guān)內(nèi)容扼要介紹如下：

一、人類免疫缺陷病毒(HIV)概述：

（一）艾滋病病原體的發(fā)現(xiàn)和命名：

(二)HIV病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)、分類和分型

HIV病毒是帶有包膜的RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒，在分類上屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科中的慢病毒亞科。目前發(fā)現(xiàn)有HIV-1和HIV-2兩型?，F(xiàn)已將HIV-1分為M組，共10個亞型(A-J)和O組，HIV-2也至少有6個亞型（A-F）。在我國流行的是HIV-1，檢測到的亞型有8種之多，其中B亞型幾乎見于我國各個地區(qū)，而C亞型主要見于我國西南和西北地區(qū)，E亞型則多見于東南沿海和西南邊境地區(qū)。

HIV病毒呈球形或卵圓形顆粒，直徑100-140mm，具有包膜。包膜是在病毒出芽釋放過程中獲得的。從脂質(zhì)膜上延伸出來的刺和園頭是糖蛋白(gp)。病毒顆粒內(nèi)部為核心，具有蛋白質(zhì)衣殼，里面有兩個相同拷貝的核酸(RNA)和病毒的三種酶：逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)、整合酶和蛋白酶。

HIV基因組(RNA)含有9個基因，可分為結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因。結(jié)構(gòu)基因包括gag、pol和env3個，皆為調(diào)節(jié)基因。

(三)實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃與診斷技術(shù)密切相關(guān)的HIV抗原

由三個結(jié)構(gòu)基因編碼的HIV-1抗原如下：
1、gag蛋白：位于病毒顆粒內(nèi)核心部位，主要有分子量為55000道爾頓的蛋白質(zhì)(P)，稱P55。P55抗原是前體蛋白，在感染過程的早期產(chǎn)生，爾后裂解成其他核蛋白，包括P24、P17和P15等。

2、env(包膜)糖蛋白：包膜抗原皆為糖蛋白(gp)，根據(jù)分子量分別稱為gp160、gp120和gp41。gp160是前體蛋白，是在感染過程中產(chǎn)生的一種成份，隨后裂解成gp120和gp41。gp120是外膜蛋白，組成外膜的72個刺突和園頭。gp41為跨膜蛋白。二者共同參與病毒與突主細(xì)胞CD4分子的粘附。

3、pol(聚合酶)蛋白質(zhì)：包括P66(RT)、P51和P31(整合酶或核酸內(nèi)切酶)。
盡管HIV-1和HIV-2抗原之間有交叉，但它們也有各自的特異性抗原。

大多數(shù)交叉反應(yīng)是由抗核心抗原的抗體所致，因?yàn)檫@二種不同病毒的gag抗原是非常保守的。各自的這些特異性抗原在HIV-1和HIV-2是相似的，但分子量可略有不同。例如，HIV-2的跨膜蛋白抗原稱為gp36，而某些人則稱之為gp41，又如主要的核心抗原為P24，但在HIV-2又稱P26。

(四)HIV感染的生物學(xué)和免疫應(yīng)答：
人體能對HIV的侵入產(chǎn)生抗體應(yīng)答，通常是在HIV感染2-10周內(nèi)機(jī)體產(chǎn)生抗體。但也有極少數(shù)人感染數(shù)月乃至數(shù)年后仍測不出抗體，故陰性結(jié)果并不說明受檢者絕無感染。絕大多數(shù)人在感染過程中都會對各種病毒抗原成份產(chǎn)生免疫應(yīng)答，抗體滴度可高達(dá)1：50000，但也可以很低。感染早期（血清陽轉(zhuǎn)時）及病程后期（免疫缺陷）時，抗體滴度均較低。

大多數(shù)病毒感染者都有IgM抗體產(chǎn)生，但HIV感染者中似乎不完全有IgM應(yīng)答。對于有IgM抗體應(yīng)答者，在窗口期檢出IgM抗體是有益的。

HIV基因組可整合到宿主細(xì)胞DNA上使機(jī)體終身帶有病毒，但機(jī)體可能很多年不出現(xiàn)癥狀，成為HIV無癥狀感染者，只是查血時發(fā)現(xiàn)抗—HIV陽性。爾后，在某些因素作用下，病毒被激活后并開始大量復(fù)制出現(xiàn)癥狀和各種合并癥，則發(fā)展成艾滋病病人，HIV病毒很容易發(fā)生變異這是研制有效疫苗的主要困難之一。

二、HIV實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃

人體感染HIV后，血液中最先出現(xiàn)HIV抗原，然后很快消失直到疾病后期才重新出現(xiàn)。幾周后出現(xiàn)IgM抗體并很快消失，此后,IgG抗體出現(xiàn)并一直存在。因此，HIV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷以抗體檢測為主，病毒及相關(guān)抗原的檢測為輔。

抗體檢測分為初篩試驗(yàn)和確證試驗(yàn)兩種，初篩試驗(yàn)為陽性的血清必須進(jìn)一步確證，確證為陽性的方可報告為HIV感染陽性。

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)主要用于檢測血漿中HIV的RNA含量，目前主要用于預(yù)測母親將HIV傳染給胎兒的可能性以及新生兒的HIV感染狀況。此外，尚可用于判斷病人的預(yù)后及監(jiān)測抗病毒治療的效果。

（一）標(biāo)本收集
HIV感染者血清標(biāo)本的收集按常規(guī)方法進(jìn)行，靜脈抽血，不加抗凝劑。標(biāo)本在室溫或4℃冰箱靜置24小時，待血清析出后作抗體檢測。污染標(biāo)本可短時間離心后取上清液作檢測，但解釋結(jié)果時應(yīng)慎重。
用于檢測HIV抗原的血液樣本與檢測抗體的樣本的處理有所不同，根據(jù)需要，血液樣本需進(jìn)行核酸處理。采用定量PCR方法檢測病毒含量時，加入肝素的血漿，檢測的RNA含量較未加肝素的血漿樣本高。

檢驗(yàn)人員應(yīng)注意自身的防護(hù)，在未證實(shí)之前，所有的標(biāo)本均應(yīng)當(dāng)作“陽性”標(biāo)本看待。

（二）HIV抗體的初篩檢測

初篩試驗(yàn)的要求是敏感性高，理論上要求達(dá)到100%，盡可能避免漏掉可能陽性的對象，相對來說，對特異性要求不是太嚴(yán)，允許有少量假陽性，這些假陽性可以通過重復(fù)試驗(yàn)和確證試驗(yàn)排除。

HIV抗體初篩檢測的方法很多，如酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)、明膠顆粒凝集實(shí)驗(yàn)(gelatineparticleagglutinationassay,PA)、乳膠凝集實(shí)驗(yàn)(latexagglutinationassay,LA)、各種快速檢測實(shí)驗(yàn)(rapidtests)、放射免疫實(shí)驗(yàn)(radioimmunoassay)等。這些實(shí)驗(yàn)使用的抗原早期是完整病毒的裂解產(chǎn)物，稱為第一代試劑，這種抗原常常由于含有宿主細(xì)胞的成分而出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，為了獲得可接受的特異性而稀釋標(biāo)本使試劑的敏感性也有所下降，同時這種抗原制備和純化都比較困難，危險性大。第二代試劑使用重組或合成多肽HIV抗原，選擇與免疫反應(yīng)相關(guān)的抗原決定簇，敏感性和特異性均有所提高，這類抗原制備也更為安全、容易、重復(fù)性好。應(yīng)該注意的是重組抗原有時由于含有載體的組分而出現(xiàn)假陽性結(jié)果，多肽抗原由于缺乏合適的立體構(gòu)象有可能使敏感性下降從而導(dǎo)致假陰性。使用重組或合成多肽抗原制備的雙抗原夾心法試劑盒常常被稱為第三代試劑，這種試劑可以檢測針對HIV抗原的所有抗體亞類，包括IgG、IgA、IgM、IgE、IgD，同時不需要將標(biāo)本過度稀釋來保證特異性，因而具有較高的敏感性。第四代試劑除使用重組或合成多肽抗原外還包被了P24抗體，可同時檢測抗原和抗體。

1．酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）是最常見的HIV實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃抗體檢測方法，它具有準(zhǔn)確性高、價格低廉、判斷結(jié)果有客觀標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)果便于記錄和保存等優(yōu)點(diǎn)，適合于大批量標(biāo)本的檢測，是獻(xiàn)血員篩選和臨床診斷最常用的方法。

（1）方法和原理：使用最多的ELISA方法是間接法，這種方法的原理是將HIV抗原包被到微孔板或其他固相載體上，如標(biāo)本中含有HIV抗體，則抗體就會和固相載體上的HIV抗原結(jié)合，洗滌去除未結(jié)合的非特異性抗體，加入酶標(biāo)記的抗人免疫球蛋白抗體與HIV抗體結(jié)合，形成HIV抗原－HIV抗體－酶標(biāo)記的抗人免疫球蛋白抗體復(fù)合物，最后加入底物發(fā)生酶催化的顯色反應(yīng)，測定光密度值(opticaldensity,OD)，與判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，就可以得出標(biāo)本中HIV抗體是陽性或陰性的結(jié)果了。間接法使用的標(biāo)記抗體通常是抗人IgG，為了提高敏感性有時也加入抗人IgM。這種方法的特異性由包被于固相載體上的HIV抗原決定，相對來說特異性不高，存在非特異性問題。

另一種常用的ELISA方法是雙抗原夾心法，將HIV抗原包被到固相載體上，標(biāo)本中的HIV抗體與抗原結(jié)合形成復(fù)合物，由于抗體的雙價或多價性，它同時還能與其他抗原結(jié)合，加入酶標(biāo)記的同一類HIV抗原分子時，后者就會與固相載體上的抗體結(jié)合，形成HIV抗原－HIV抗體－酶標(biāo)記HIV抗原復(fù)合物，最后加入底物發(fā)生酶催化的顯色反應(yīng)，測定光密度值，與判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，就可以得知標(biāo)本中HIV抗體是陽性還是陰性。

還有一種ELISA方法是競爭法。它的主要特點(diǎn)是酶標(biāo)記抗體是特異性的HIV抗體。標(biāo)本中的HIV抗體與酶標(biāo)記HIV抗體競爭固相載體上的HIV抗原，操作時同時加入標(biāo)本和酶標(biāo)記HIV抗體，如標(biāo)本中的抗體濃度高，酶標(biāo)記HIV抗體就不能與固相載體上的HIV抗原結(jié)合或結(jié)合得很少，顯色反應(yīng)就較弱，相反，如標(biāo)本中的HIV抗體含量很少或沒有，大量的酶標(biāo)記HIV抗體將與固相載體上的HIV抗原結(jié)合，顯色反應(yīng)就很強(qiáng)。因而在競爭法中，光密度值與標(biāo)本中的抗體含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。這種方法是將標(biāo)本與酶標(biāo)抗體同時加入，需時更短，另外這種方法具有較好的特異性。

（2）結(jié)果的判斷：ELISA方法是根據(jù)臨界值(cutoffvalue,CO)判斷結(jié)果的。臨界值是將檢測的陽性和（或）陰性對照的OD值代入廠商提供的計(jì)算公式計(jì)算出來的判斷陽性和性結(jié)果的界值。對于間接法和雙抗原夾心法，標(biāo)本OD值與臨界值的比值大于等于1（S／CO≥1）為陽性；對于競爭法，標(biāo)本OD值與臨界值的比值小于等于1（S／CO≤1）為陽性。
2．從尿液中測抗體
尿液艾滋病病毒（HIV－1）抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒（CalypteTMHIV-1尿液EIA）是酶免疫測定方法在體外檢測尿液中HIV－1抗體。此法用于實(shí)驗(yàn)室輔助臨床HIV感染診斷。在確定標(biāo)本HIV－1抗體的結(jié)果之前，根據(jù)美國疾病控制中心推薦的HIV抗體的診斷步驟，此項(xiàng)檢測重復(fù)陽性的標(biāo)本，用卡里普特公司的劍橋生物HIV－1尿液WesternBlot試劑盒進(jìn)行確診。
近年與血液檢查相比，尿液檢查有多種優(yōu)點(diǎn)。在尿液中一般不存在HIV病毒。卡里普特公司的劍橋生物HIV－1尿液WesternBlot試劑盒，可對于尿液EIA重復(fù)陽性標(biāo)本做確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。
尿液艾滋病病毒（HIV－1）抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒（calypteTMHIV-1尿液EIA）是利用重組的HIV－1表面抗原在尿液中檢測HIV－1抗體。微孔板的孔中包被gp160膜抗原。把尿液標(biāo)本或?qū)φ张c標(biāo)本緩沖液一起加入孔中溫育。如果標(biāo)本中存在HIV－1膜抗原的抗體，它們將與孔中的抗原結(jié)合。標(biāo)本緩沖液用來減低孔中其它蛋白及抗體對孔壁的非特異性結(jié)合。通過洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)。然后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白抗體并溫育。酶聯(lián)物與孔中結(jié)合到抗原的HIV－1抗體結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的酶聯(lián)物，然后加入底物（p-NPP）。如標(biāo)本中含有HIV－1抗體，酶將使孔內(nèi)液體由無色變?yōu)辄S色，顏色的強(qiáng)度與標(biāo)本中抗體含量成正比。反應(yīng)用EDTA終止，用酶標(biāo)儀在405nm處測吸收峰而讀取結(jié)果。
試劑盒中包括陽性及陰性對照，每板應(yīng)做2個陽性對照及3個陰性對照，將陰性對照平均吸收值加0.18得到cutoff值，標(biāo)本是通過與Cutoff值比較來判斷是否為陽性或陰性。
第一次檢測陽性標(biāo)本應(yīng)用同一標(biāo)本再重復(fù)檢測，如果重復(fù)檢測仍為陽性，標(biāo)本為重復(fù)陽性標(biāo)本。重復(fù)陽性標(biāo)本用卡里普特公司的劍橋生物HIV－1WesterBlot試劑盒進(jìn)一步確認(rèn)。
3．膠體金法檢測HIV1/2抗體實(shí)驗(yàn)
膠體金法檢測HIV抗體是一種不需要任何儀器設(shè)備的血清／血漿檢測法，它利用免疫層析分析原理來快速檢測血清／血漿中是否含有HIV抗體，從而用于判斷人體是否受到HIV1型／HIV2型病毒感染。
（1）方法和原理
試劑盒采用高度特異性的抗體抗原反應(yīng)及免疫層析分析技術(shù)來定性檢測血清／血漿中是否含有HIV抗體，試劑盒含有被事先固定于膜上測試區(qū)（T）的重組HIV抗原和質(zhì)控區(qū)（C）的抗-proteinA抗體。
測試時，血標(biāo)本滴入試劑盒加樣孔（S）內(nèi)，血標(biāo)本中的HIV抗體與預(yù)包被在膜上的proteinA膠體金結(jié)合物反應(yīng)。然后，混合物隨之在毛細(xì)管向上層析，在測試區(qū)（T）與固定在膜上的重組HIV抗原反應(yīng)。如果血清中含有HIV－1抗體或HIV－2抗體，在測試區(qū)內(nèi)（T）會出現(xiàn)一條紅色條帶，表明是陽性結(jié)果。如果在測試區(qū)內(nèi)（T）沒有出現(xiàn)紅色條帶，則血清中不含有HIV抗體，表明是陰性結(jié)果。無論HIV抗體是否存在于血清中，混合物都會繼續(xù)向上層析至質(zhì)控區(qū)（C），質(zhì)控區(qū)的抗ProteinA與ProteinA膠體金結(jié)合物反應(yīng)出現(xiàn)一條紅色條帶。質(zhì)控區(qū)內(nèi)（C）所顯現(xiàn)的紅色條帶是判定是否有足夠血標(biāo)本，層析過程是否正常的標(biāo)準(zhǔn)，同時也作為試劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。
（2）結(jié)果判定
陽性（＋）：兩條紅色帶出現(xiàn)。一條位于測試區(qū)內(nèi)（T），另一條位于質(zhì)控區(qū)內(nèi)（C）。
陰性（－）：僅質(zhì)控區(qū)（C）出現(xiàn)一條紅色條帶，在測試區(qū)內(nèi)（T）無紅色條帶出現(xiàn)。
無效：質(zhì)控區(qū)（C）未出現(xiàn)紅色條帶，表明不正確的操作過程或試劑盒已變質(zhì)損壞。在任何情況下，應(yīng)重新測試。如果問題仍然存在，應(yīng)立即停止使用此批號產(chǎn)品，并與當(dāng)?shù)毓?yīng)商聯(lián)系。
注意：由于樣本中HIV抗體滴度的不同，測試區(qū)（T）內(nèi)的紅色條帶會顯現(xiàn)出不同深淺的顏色。但是，本試劑盒的測試結(jié)果不能做為判定樣本中抗體滴度高低的依據(jù)。
4.明膠顆粒凝集試驗(yàn)
明膠顆粒凝集試驗(yàn)(PA)是一種快速的HIV血清抗體的檢測方法。先將樣品稀釋，然后加入包被抗原的明膠顆粒，混勻后保溫(一般為室溫)。由于操作方便，且無需特殊儀器設(shè)備，很適合于對少量標(biāo)本的檢測。當(dāng)血清或血漿中有HIV抗體存在時，經(jīng)HIV實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃抗原致敏的明膠顆粒與抗體發(fā)生抗原—抗體相互作用，產(chǎn)生肉眼可見的凝集反應(yīng)。
(1)操作方法
①待測血清從1：4開始作倍比稀釋。
②1：8血清稀釋孔加25μ1非致敏粒子，1：16血清稀釋孔加25μ1致敏粒子。
③設(shè)置陽性對照血清，使其終末滴度為1：128。
④振蕩混勻，加好蓋板，室溫(20℃)靜置2小時觀察結(jié)果
(2)結(jié)果觀察
①明膠顆粒沉積在孔底，周邊平滑，或形成致密圓圈為陰性結(jié)果；
②孔底呈現(xiàn)均勻的凝集現(xiàn)象，或形成一個大的邊緣不整齊的圓圈，為陽性結(jié)果。
(3)注意事項(xiàng)
標(biāo)本應(yīng)為新鮮標(biāo)本，無溶血。若標(biāo)本與致敏粒子、非致敏粒子均出現(xiàn)反應(yīng)，應(yīng)將標(biāo)本先和非致敏粒子吸附，然后再作檢測。
明膠顆粒凝集試驗(yàn)

孔號	1	2	3
待檢血清 血清稀釋液 未致敏顆粒 致敏顆粒 稀釋度	1：4	1:16	1:32

(三)、確證（確認(rèn)）試驗(yàn)
確證（確認(rèn)）試驗(yàn)主要用蛋白印跡試驗(yàn)(WesternBlot,WB)。蛋白印跡法是將HIV病毒蛋白用十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PolyacrylamideGel)電泳。將分子量大小不等的蛋白帶分離開來，然后再把這些已經(jīng)分離的不同蛋白帶電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。將此膜切割成條狀，每一條硝酸纖維膜上均含有經(jīng)電泳分離過的HIV實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃病毒抗原。將待檢血清樣品用稀釋液稀釋成1：100，再把它直接放到硝酸纖維膜上，并靜置一段時間，使其充分接觸反應(yīng)，血清中若含有HIV抗體，就會與硝酸纖維膜條上的抗原帶相結(jié)合。經(jīng)過沖洗去掉未結(jié)合的多余抗體，并加入抗人－IgG酶結(jié)合物，洗去未結(jié)合的抗人－IgG酶結(jié)合物，加入底物，即可使有反應(yīng)的抗原、抗體結(jié)合條帶呈現(xiàn)紫褐色，這表示陽性反應(yīng)。此法一般是在ELISA或其它初篩檢測陽性后再用來確認(rèn)。
1、結(jié)果判斷
a、膜條沒有條帶出現(xiàn)表示陰性（一）
b、待檢標(biāo)本出現(xiàn)條帶的色度小于弱陽性對照gp120帶色度時表示可疑（±）。
c、待檢標(biāo)本出現(xiàn)的條帶色度相當(dāng)于弱陽性照gp120帶色度但比強(qiáng)陽性條帶的色度弱時表示（+）。
d、待檢標(biāo)本出現(xiàn)的條帶色度相當(dāng)于或大于強(qiáng)陽性對照gp120帶色度時表示（++）。
GAGP55，P24，P17
ENVgp160,gp120,gp41
POLp65,p51,p32
(1)以上三個基因組里各出現(xiàn)任何一條帶，而且其色度在“+”或“±”以上者表示陽性。最近，美國CDC規(guī)定：在P24，gp41,gp120/gp160四條帶中出現(xiàn)任何二條帶者表示陽性。
(2)有一個或多個條帶但不符合陽性標(biāo)準(zhǔn)者表示可疑。
(3)未出現(xiàn)任何條帶者表示陰性。
2、注意事項(xiàng)：
a、每次反應(yīng)之間，要充分洗凈。
b、反應(yīng)條件是室溫20-30℃。
c、試劑條只能用鑷子夾取，不能用手接觸。
d、每次試驗(yàn)需設(shè)強(qiáng)陽性、弱陽性和陰性對照。
（四）檢驗(yàn)程度
初篩試驗(yàn)每一次檢測陰性者可報告陰性，若第一次檢測陽性，則需進(jìn)行復(fù)測，復(fù)測時（最好用不同類型的試劑）可同時測定兩孔，判定方法如下：
第一次檢測第2次檢測結(jié)果判定
（-）陰性
（+）（-）（-）陰性
（+）（+）（-）/（+）陽性
初篩陽性的標(biāo)本不能發(fā)報告，必須將血樣或血袋送本?。ū臼校┌滩”O(jiān)測檢驗(yàn)中心確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步做確證試驗(yàn)。確證試驗(yàn)陽性者，由?。ㄊ校┍O(jiān)測中心給送檢單位發(fā)出抗-HIV實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃陽性報告，同時上報衛(wèi)生廳（局）和衛(wèi)生部疾病控制司備案。確認(rèn)試驗(yàn)陽性和可疑的血袋均需送確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室妥善處理，絕對不能發(fā)出使用。

三、PCR在HIV實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃檢測中的應(yīng)用

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PolymeraseChainReaction,PCR)又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)，是近年來發(fā)展起來的一種的短時間內(nèi)大量擴(kuò)增特定DNA片段的新技術(shù)。應(yīng)用該方法，可很容易地查到原先那些由于DNA拷貝數(shù)少而不足以檢測出來的病毒DNA或其它致病基因，從而大大地推動了疾病的DNA診斷和分子克隆基因組DNA工作的發(fā)展。由于該項(xiàng)技術(shù)可將極微量的DNA特異地?cái)U(kuò)增上百萬倍，甚至能檢測到單分子或每10萬個細(xì)胞中僅含1個DNA分子的樣品。它是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法，其特性是由兩個人工合成的引物序列決定的。所謂引物就是與待擴(kuò)增DNA片段兩翼互補(bǔ)的寡核苷酸，其本質(zhì)是ssDNA片段。

待擴(kuò)增DNA模板加熱變性后，兩引物分別與兩條DNA的兩翼序列特異復(fù)性。此時，兩引物的3’端相對，5’端相背。在合適條件下，由TaqDNA聚合酶催化引物介導(dǎo)的DNA合成，即引物的延伸。這種實(shí)驗(yàn)過程是在溫度控制下進(jìn)行的，一個變性--復(fù)性--延伸的過程就是一個PCR循環(huán)。PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)；延伸的產(chǎn)物經(jīng)第二循環(huán)變性，亦與引物互補(bǔ)，作為引物引導(dǎo)DNA合成的新模板；因此，第二循環(huán)后延伸的模板由第一循環(huán)的4條增為8條，依此類推，以后每一個循環(huán)后的模板均比前一個循環(huán)增加1倍。理論上講PCR擴(kuò)增DNA產(chǎn)量是呈指數(shù)上升的。PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感性高、快速、簡便、對起始材料質(zhì)量要求低等特點(diǎn)。

PCR用于檢測HIV的優(yōu)點(diǎn)如下：1.與傳統(tǒng)檢測抗體的方法相比，其靈敏度和特異性更高，從而對HIV的定量檢測提供了有效的手段；2.不依賴于宿主的免疫反應(yīng)，無須等到免疫系統(tǒng)對HIV產(chǎn)生抗體后才能檢定宿主受HIV感染的狀態(tài)，這有利于對血清陽轉(zhuǎn)以前標(biāo)本的檢測和對陽性母親所生嬰兒的HIV感染的調(diào)查；3.對潛伏狀態(tài)的HIV的檢測不依賴于HIV在宿主細(xì)胞的生長活性。

綜上所述，PCR是對HIV實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃核酸檢測的有效手段，是對HIV病毒分離、血清學(xué)抗體檢測方法的必要補(bǔ)充。在HIV感染的確診和艾滋病診斷中，核酸的檢測對病原活動的監(jiān)控更加有效方便，因?yàn)楹怂釓?fù)制的有無和數(shù)量是體內(nèi)病毒復(fù)制情況的直接反映。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)主要用于檢測血漿中HIV的RNA含量，目前主要用于預(yù)測母親將HIV傳染給胎兒的可能性以及新生兒的HIV感染狀況。此外，尚可用于判斷病人的預(yù)后及監(jiān)測抗病毒治療的效果。

四、艾滋病病原學(xué)診斷中的幾個問題。

1、明確不同實(shí)驗(yàn)方法的意義和適應(yīng)范圍：HIV血清學(xué)檢測分為初篩和確證兩類。初篩實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)的陽性結(jié)果，應(yīng)再次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若仍為陽性，則應(yīng)用確證實(shí)驗(yàn)去證實(shí)，只有確證實(shí)驗(yàn)是陽性的標(biāo)本方可報告為HIV抗體陽性。另外，能引起艾滋病的病毒分為兩型，即HIV-1和HIV-2，兩型病毒間只有少部分抗原有交叉（主要是Gag基因編碼的核蛋白）。因而各型病毒試劑只能有效地檢測出同型病毒的抗體。

2、針對HIV感染不同時期選用不同的檢測手段。HIV原發(fā)感染后的兩周內(nèi)，用任何方法均無法查到病毒的存在，2周后出現(xiàn)病毒血癥，此時可用抗原檢測方法、檢查病毒抗原或測定病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性，而不能用血清學(xué)方法，因?yàn)榭贵w要到感染后6-8周才會出現(xiàn)。此后就只能用抗體檢測方法，直到艾滋病的出現(xiàn)，因?yàn)樵谶@段時間HIV抗原很難從血清中查到，待發(fā)展到艾滋病階段時才會重新出現(xiàn)。

3、HIV抗體測定的靈敏度、特異度和預(yù)測值：

表1HIV抗體測定的靈敏度、特異度和預(yù)測值

檢驗(yàn)結(jié)果	抗體情況		總計(jì)
陽性	有 真的 陽性（a）	無 假的 陽性(b)	所有陽性 試驗(yàn)（a+b）
陰性	假的 陰性(c) 都有抗體	真的 陰性（d） 都無抗體	所有陰性 試驗(yàn)（c+d） 總計(jì)
	（a+c）	(b+d)	(a+b+c+d)

敏感性：是指在有抗體存在的標(biāo)本中，檢出抗體的準(zhǔn)確性。敏感性低的試驗(yàn)將有許多假陰性。
敏感性=a/a+c
特異性：是指在沒有抗體存在的標(biāo)本中，檢測其抗體缺失的準(zhǔn)確性。特異度低的試驗(yàn)將有許多假陽性。

特異性=d/b+d
理想的是，一種試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)具有100%的敏感性和100%的特異性。但實(shí)際上，沒有一種生物試驗(yàn)?zāi)軡M足這樣的要求。但在敏感性和特異性最高的試驗(yàn)方法當(dāng)中現(xiàn)行的HIV檢測方法還是可取的，在理想的實(shí)驗(yàn)室條件下，許多市售的HIV抗體試驗(yàn)方法的敏感性和特異性都在99%以上。除非由于檢驗(yàn)人員造成人為誤差，這種檢驗(yàn)方法所固有的特性是不會出現(xiàn)明顯改變的。

陽性試驗(yàn)預(yù)測值（PPV）a/a+b
陰性試驗(yàn)預(yù)測值（NPV）d/c+d
試劑的敏感性和特異性可以衡量它的優(yōu)劣，但并不能決定一個測定結(jié)果正確與否的可能性大小，后者是由測定的預(yù)測值決定的。一個測定的陽性或陰性預(yù)測值，即這個陽性或陰性的結(jié)果是真陽性或真陰性的可能性。這除與所用試劑的優(yōu)劣有關(guān)外，還取決于測定對象本身患病率的高低。如表2所示，一個陽性HIV血清檢測結(jié)果的真實(shí)性，對舊金山同性戀人群可高達(dá)99.88%，而對正常人則為18.94%，反之，一個陰性結(jié)果的真實(shí)性對前者不足90%，而對后者則高達(dá)99.997%。

表2ELISA法HIV-1抗體測定的預(yù)測值

人群		預(yù)測值
		陽性		陰性
舊金山同性戀人群		99.88		89.06
美國非高危人群		18.94		99.997

因而我們在實(shí)際檢測工作中，對我國普通公民初篩試驗(yàn)結(jié)果陰性的預(yù)測值是非常高的,即可初步排除HIV感染的可能性，而出現(xiàn)陽性結(jié)果，則必需慎之又慎，要嚴(yán)格經(jīng)蛋白印跡等確定實(shí)驗(yàn)證實(shí)后方可報告。相反，對來自疫區(qū)的外國人或在疫區(qū)長期居住的歸國人員可疑陰性結(jié)果，則不能輕易放過，以免因漏診而造成嚴(yán)重的后果。

4、HIV抗體檢測反應(yīng)強(qiáng)度與HIV感染的概率

許多HIV抗體檢測方法除了是一種定性實(shí)驗(yàn)外，還同時是一種半定量實(shí)驗(yàn)。這可表現(xiàn)于測定不同稀釋度的血清的反應(yīng)性，得出陽性血清的最高稀釋度，而ELISA方法則可根據(jù)光密度（0D）值的強(qiáng)度直接確定。反應(yīng)性越強(qiáng)的血清，含有HIV抗體的可能性也就越大。例如，表3中的HIV感染率為30/10萬的正常獻(xiàn)血員，中等強(qiáng)度反應(yīng)時，HIV抗體陽性概率僅為1.13%，而在高強(qiáng)度反應(yīng)時該概率則激增到86.1%，與同樣強(qiáng)度的來自HIV感染率極高的吸毒人群（45000/10萬）的概率相近。

表3HIV感染機(jī)率與ELISA反應(yīng)強(qiáng)度的關(guān)系

人群HIV感染率ELISA反應(yīng)強(qiáng)度(%)

(/10萬)低度中度高度 非高危獻(xiàn)血員300.00071.1386.1 高危獻(xiàn)血950.00223.4895.2 軍人1500.00365.3996.9 吸毒者450001.9196.699.9

注：（1）數(shù)字表示相應(yīng)強(qiáng)度反應(yīng)的血清中含有HIV抗體的概率（%）；
（2）低度為OD<1，中度為1，高度為OD>6。

5、檢測結(jié)果的處理，如果在HIV檢測中發(fā)現(xiàn)了陽性結(jié)果，一方面應(yīng)立即按國家法定乙類傳染病上報程序迅速上報。對已成年患者應(yīng)通知本人，并向其說明陽性檢測結(jié)果的意義以及HIV感染與艾滋病之間的關(guān)系，同時還要忠告他（她）有義務(wù)不從事可將病毒傳給他的活動。另一方面，檢測單位也有責(zé)任為患者保密，以使其在原來的環(huán)境中生活下去。這不僅僅是出于對患者的人道，避免因無知而產(chǎn)生的歧視，同時也是有效控制艾滋病蔓延的重要保證。可以想象，如果艾滋病病人或HIV感染者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，就被趕出單位、學(xué)校、家庭，還會有誰再來做檢側(cè)。這樣勢必會使攜帶HIV的人潛伏于社會無法被發(fā)現(xiàn)，艾滋病將傳播得更快、更廣。

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